Im Deutschen Bund herrschte ein labiles Gleichgewicht zwischen den sich gegenseitig misstrauenden Rivalen Preußen und Österreich. Ihr gemeinsam erfochtener Sieg im Deutsch-Dänischen-Krieg 1864 überdeckte den jahrzehntelangen Dualismus nur oberflächlich. Im Frühjahr 1866 spitzte sich der preußisch-österreichische Gegensatz zu. Beiderseitige Rüstungsanstrengungen und Geheimverträge mit europäischen Staaten hatten die Spannungen verstärkt, die schließlich wegen des Verwaltungskonflikts um Holstein und Schleswig eskalierten. Österreich wollte die endgültige Regelung der schleswig-holsteinischen Frage dem Bundestag in Frankfurt überlassen, der von beiden Seiten immer öfter zum öffentlichen Austragungsort ihrer machtpolitischen Gegensätze geworden war.
Da Preußen Gefahr lief, von Österreich und antipreußisch eingestellten Staaten in die Defensive gedrängt zu werden, warf der preußische Ministerpräsident Otto von Bismarck Österreich den Bruch der 1865 unterzeichneten "Gasteiner Konvention" vor. Sie hatte Schleswig preußischer und Holstein österreichischer Verwaltung unterstellt. Am 7. Juni 1866 marschierten preußische Truppen in Holstein ein, das von Österreich zuvor kampflos geräumt worden war. Daraufhin stimmten die größeren deutschen Staaten im Bundestag dem Antrag Wiens auf Mobilisierung eines Bundesheers zu. Preußen wiederum deklarierte dies als unzulässige Kriegserklärung und trat aus dem Deutschen Bund aus, den es für erloschen erklärte.
Die Armeen aus Österreich, Bayern, Württemberg, Hannover, Sachsen, Baden, Kurhessen, Hessen-Darmstadt, Nassau, Sachsen-Meiningen, Liechtenstein, Reuß ältere Linie sowie Frankfurt bildeten die offiziell vom Deutschen Bund aufgestellten Koalitionstruppen. Preußen erhielt Unterstützung von Oldenburg, beiden Mecklenburgs, Braunschweig, den mittel- und norddeutschen Kleinstaaten, den Städten Hamburg, Bremen und Lübeck sowie vom 1861 neu gegründeten Königreich Italien, mit dem Preußen am 8. April 1866 ein gegen Österreich gerichtetes Bündnis eingegangen war.
Weder Preußen noch Österreich sprachen 1866 offiziell Kriegserklärungen aus. Stattdessen überreichten preußische Parlamentäre den Österreichern im Juni Notifikationen, aus denen hervorging, dass Preußen sich mit Österreich nun im Kriegszustand befinde. Entschieden wurde der Krieg nach nur wenigen Wochen in der Schlacht von Königgrätz am 3. Juli 1866. Im europäischen Ausland wurde der überraschend schnell errungene Sieg Preußens mit Misstrauen betrachtet. Nach diplomatischen Verhandlungen akzeptierte der selbst auf Ausdehnung seines Einflusses in Deutschland bestrebte französische Kaiser Napoleon III. zwar die Machtverschiebung zugunsten Preußens. Frankreich machte aber deutlich, dass die territorialen Einverleibungen nicht über die Mainlinie hinaus gehen dürften.
Der Friede von Prag vom 23. August 1866 hatte für Österreich ein vergleichsweise glimpfliches Ergebnis: Abgesehen von dem an Italien fallenden Venetien sicherte ihm der Vertrag zumindest territoriale Unversehrtheit zu. Ungleich härter traf es Hannover, Kurhessen, Nassau und Frankfurt, die ohne Rücksicht auf dynastische Gesichtspunkte von Preußen annektiert wurden. Damit schloss Preußen die letzte Lücke zu einem zusammenhängenden Staatsterritorium zwischen der Memel im Osten und dem Rhein im Westen. Zugleich war mit dem Prager Frieden das Ende des seit 1815 bestehenden Deutschen Bundes besiegelt und Österreich aus Deutschland herausgedrängt. Preußen besaß nun die uneingeschränkte Vormachtstellung und gründete den Norddeutschen Bund.